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发布于:2019-06-12  |   作者:365bet赌博网站
使用线粒体靶向荧光探针mt-roGFP 2检测人肝细胞肝细胞中线粒体ROS水平
目的:线粒体ROS(ROS)物种通过靶向线粒体感应氧化还原敏感绿色荧光蛋白(荧光探针roGFP2 mt)为线粒体设计,客观地检测人HepG2肝细胞癌细胞(HepG2细胞及其他细胞)健康肝癌化疗的基础。
方法通过无缝克隆构建pLenti-CMV-mt-roGFP2-PGK纯慢病毒载体,并通过测序鉴定。
将慢病毒载体plenti-CMV-mt-roGFP2-PGK纯质粒和包装pVSVg,Anterior和PGAG-Pol共转染到293T人肾上皮细胞中以获得mt-roGFP2慢病毒颗粒和病毒滴度它被检测到。
将制备的mt-roGFP2慢病毒颗粒感染HepG2细胞,荧光显微镜和Western blotting检测HeGG2细胞中roGFP的表达。
将在对数生长期稳定表达mt-roGFP2的HepG2细胞(HepG2-mtroGFP2细胞)与线粒体荧光探针MitoTracker一起温育,并通过共聚焦激光显微镜观察荧光探针mt-roGFP2的亚细胞定位。。
HepG2-mt-roGFP2细胞的对数生长期通过零。
处理5mmol / L过氧化氢(H 2 O 2)和1mmol / L二硫苏糖醇(DTT)。用Nikon A1R激光扫描共聚焦显微镜拍摄相同的细胞,用ImageJ软件分析荧光图像。
结果:成功构建了慢病毒载体pLentiCMV-mt-roGFP2-PGK-puro。
制备的慢病毒mt-roGFP2的平均滴度为4。
04 x 10-8 IU / mL。
荧光探针mt-roGFP2在HepG2细胞中稳定表达,并正确导向HepG2细胞的线粒体,成功构建了HepG2-mt-roGFP2细胞。
外源氧化剂H 2 O 2的添加导致HepG 2→Mt?RoGFP2细胞中线粒体ROS水平显着增加,荧光比为1(405nm / 488nm)。
19升至3。
如图98所示,添加还原剂DTT可以将其荧光比降低至1。
25年
结论线粒体荧光探针mt-roGFP2可实时检测HepG2细胞线粒体ROS水平,并实时检测。
14至17岁


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